Introduction

En génie génétique, la technique permettant de désactiver un gène en remplaçant son allèle normal par un allèle mutant non fonctionnel se nomme Knock-Out (KO). Contrairement à la transgénèse classique consistant à introduire un gène étranger dans le génome de l’hôte, cette méthode se base sur le principe de la recombinaison homologue, permettant de remplacer dans le génome une portion de gène sauvage par une nouvelle portion préalablement modifiée. La recombinaison homologue chez les Mammifères a connu un important développement au cours des années 70-80, récompensé dernièrement par un Prix Nobel de Médecine. Ces recherches permirent de mettre au point la première souris transgénétique conçue par recombinaison homologue en 1989. La technique du knock-out, très employée en immunologie et en biologie du développement notamment, permet de mieux comprendre le fonctionnement d’un gène particulier et les conséquences de son inactivation sur le développement et la physiologie de l’organisme. Son application au modèle murin représente donc un choix technologique judicieux afin de mieux comprendre l’implication de certains gènes chez les mammifères, et d’extrapoler, dans les limites du possible, ces résultats à nos connaissances en matière de génétique humaine.

Figure 1 : Une souris KO chez laquelle un gène impliqué dans la croissance du pelage a été disrupté (gauche) comparée à une souris normale (droite). Crédits : genome.gov

Production de souris KO

L’obtention de souris KO (Knock-Out) se déroule en plusieurs étapes : tout d’abord, l’isolement de cellules-souches embryonnaires à partir de blastocystes murins ; ensuite la transfection de ces cellules avec une construction cDNA d’intérêt et la sélection des cellules souches recombinées ; puis l’injection des cellules souches dans des embryons de souris ; et enfin les croisements successifs entre générations de souris afin d’obtenir des souris KO homozygotes. Nous reviendrons bien entendu en détails sur ces étapes au cours de cet exposé.

1. Isolement et transfection des cellules souches embryonnaires

Des cellules souches embryonnaires sont tout d’abord prélevées à partir de blastocystes murins et mises en culture (sur une couche de cellules fibroblastes nourricières irradiées ou directement sur milieu nutritif. Dans ces conditions, les cellules souches embryonnaires restent pluripotentes et se différencieront en tout les types cellulaires.

Ces cellules souches sont ensuite transfectées à l’aide d’une construction ADNc portant un exon inactivé du gène d’intérêt. Le but est de réussir une recombinaison homologue au niveau du génome des cellules souches, afin que la construction remplace son équivalent sauvage directement au niveau du gène visé et l’inactive par la suite. Pour réaliser la construction, il faut donc posséder une séquence d’ADNc du gène d’intérêt, à partir de laquelle nous allons réaliser la construction suivante :

 Insertion du gène neoR, codant pour la résistance à la néomycine. Ce gène viendra disrupter un exon du gène-cible et permettra de sélectionner par cet antibiotique les cellules recombinées.
 Conservation de deux exons sauvages flanquant l’exon disrupté, afin de faciliter la recombinaison homologue.
 Ajout du gène thHSV codant pour la thymidine kinase du HSV (herpes simplex virus). Cette enzyme confère une sensibilité au gancyclovir, analogue nucléotidique cytotoxique. Si la recombinaison est non homologue, les cellules souches y seront sensibles.

Après transfection, le pourcentage de cellules recombinées ne dépasse pas les 1%. Parmi ce faible pourcentage, la quasi-totalité ont subi des recombinaisons non homologues : la construction s’est donc insérée au hasard dans le génome. Dans 0,001 à 0,0001 % des cas, la recombinaison a bien été homologue. Il faut donc sélectionner les cellules ayant subi une recombinaison homologue. Ces dernières présentent la double résistance à la néomycine et au gancyclovir. Un traitement après transfection des cellules souches avec ces deux molécules permet donc de sélectionner les cellules recombinées homologues (phénotype NeoR et gancyclovirR).

2. Obtention de souris chimériques

Les cellules souches embryonnaires transfectées et recombinées homologues sont hétérozygotes pour le gène muté. Comme fréquemment, cet allèle muté est récessive. Ces cellules sont injectées dans des embryons de souris jaunes ou blanches (phénotype récessif). Les embryons sont ensuite transférés dans l’utérus d’une femelle pseudo-gestante. Les descendants obtenus de cette manière seront tous chimériques.

3. Sélection des générations F1 et F2

Jusqu’à présent, le suivi d’un second caractère phénotypique, comme la couleur du pelage, n’importait peu. Lors de l’obtention de souris chimériques, il a été toutefois précisé que l’embryon accepteur des cellules souches transfectées devait présenter également à l’age adulte un phénotype récessif autre que l’allèle sauvage du gène disrupté. Il s’agit ici du pelage blanc ou jaune. Afin que ce second caractère puisse être correctement employé comme second marqueur phénotypique, il nous faut le comparer à un phénotype dominant. Les embryons de souris utilisés à l’origine afin d’obtenir des cellules souches transfectables doivent donc présenter un génotype homozygote codant pour un phénotype de pelage noire. Ces souris chimères de génération F0 se sont développées à l’état embryonnaire à partir de cellules souches transfectées donnant un phénotype noir et de cellules souches natives donnant un phénotype blanc. Elles vont non seulement être zébrées de noir et de blanc, mais également donner trois types de gamètes dans les proportions suivantes :

 1/3 noir x gène ^KO
 1/3 noir x gène ^WT (Wild Type = Sauvage)
 1/3 blanc x gène ^WT

La première étape consiste à obtenir une génération F1 conservant l’allèle gène KO et permettant par la suite d’obtenir une génération F2 homozygote gène ^KO / gène ^KO. Le tableau suivant donne les détails de l’obtention souris F1 à partir d’un croisement entre chimères F0 et souris blanches :

Tableau 1 : tableau de croisement des gamètes de souris blanche avec les gamètes de souris chimérique et résultats génotypiques et phénotypiques obtenus pour la génération F1

La génération F1 permet donc d’éliminer les souris blanches également homozygotes gène WT / gène WT, mais nécessite une analyse moléculaire afin de différencier parmi les souris noires les homozygotes gène WT / gène WT des hétérozygotes gène WT / gène KO. Pour cela, l’étape suivante consiste à réaliser une analyse de l’ADN génomique des souris par southern blot afin de déterminer le génotype de chaque souris noire F1. Afin d’identifier les souris hétérozygotes, une sonde spécifique du gène neoR est préparée, puis utilisée pour révéler la présence de l’allèle KO lors du southern blot (voir annexes pour plus de détails).

Maintenant, la dernière étape consiste à croiser entre-elles les souris hétérozygotes F1 sélectionnées. Parmi les souris de la génération F2, certaines seront homozygotes gène KO / gène KO.

Tableau 2 : tableau de croisement des gamètes des parents de la génération F1 et génotypes obtenus lors de la génération F2 (en rouge, génotypes homozygotes pour l’allèle gène^KO)

Suite à ce croisement, 4 génotypes sur les 16 possibles sont homozygotes pour l’allèle gène^KO. Soit une probabilité de 25%. Comme la couleur de pelage n’est alors plus un guide fiable pour identifier les homozygotes d’intérêt, il est nécessaire de réaliser un nouveau southern blot pour chaque souris. Au final, les souris F2 sélectionnées sont donc homozygotes pour l’allèle gène^KO et sont donc utilisables afin de mener diverses expériences portant sur la disruption du gène ciblé.

La mutagenèse conditionnelle

La méthode classique présentée en détails ci-dessous est cependant limitée et discutable. En effet, l’obtention de souris homozygotes peut entraîner une mortalité embryonnaire et rendre toute analyse finale impossible. De plus, la disruption d’un gène donné dans tout l’organisme peut aboutir à un phénotype complexe, difficilement interprétable. Il devient alors nécessaire de recourir à d’autres systèmes permettant de désactiver le gène dans un ou des tissus donnés. Pour améliorer l’analyse fonctionnelle du génome, il devient alors important d’utiliser des systèmes de mutagenèse conditionnelle.

Le système loxP/CRE

Une amélioration de la technique à laquelle les chercheurs ont fréquemment recours consiste à utiliser le système loxP/CRE dans la construction moléculaire. CRE est une recombinase issue du bactériophage P1, reconnaissant un site spécifique sur l’ADN de 34 pb : loxP. Une fois amarrée sur ce site, CRE catalyse alors une recombinaison. L’intérêt de ce système est d’insérer deux sites loxP aux extrémités d’un exon, et de favoriser l’expression du gène CRE afin d’exciser l’exon hors du gène. Le gène CRE peut être également doté d’un promoteur spécifique du tissu étudié, afin de localiser son expression chez la souris. Supposons, par exemple, que des chercheurs souhaitent étudier la délétion du gène de la DNA ß Polymerase chez les lymphocytes T. Le gène doit cependant pouvoir s’exprimer correctement au cours du développement embryonnaire et dans les autres cellules, tandis qu’il sera spécifiquement disrupté chez les lymphocytes T. Pour résoudre ce problème, nous pouvons avoir recours au système loxP/CRE selon le schémas suivant :

La technologie loxP/CRE n’est cependant pas sans effets secondaires indésirables : la recombinase peut endommager les chromosomes en induisant des délétions pouvant atteindre les 20 Mpb. Des sites cryptiques loxP seraient reconnus par l’enzyme le long du génome murin, entraînant des lésions de l’ADN, une toxicité cellulaire, des phénomènes d’apoptose ou de prolifération cellulaire, ou encore une stérilité des souris. Lors de la conférence « NIH Planning Meeting for a Knockout Mouse Project » tenue en Mars 2005 à Rockville (Maryland, USA) les spécialistes réunis ont préconisé la recherche et le développement de recombinases CRE moins incertaines lors de l’utilisation du système loxP/CRE.

Systèmes inductibles

Parmi les systèmes alternatifs développés, un effort a été apporté sur l’induction de la mutation, afin de pouvoir mieux contrôler le knocking-out dans l’organisme, mais également en maîtriser les effets en fonction du temps.

Une technique simplifie tout d’abord le système en recourrant à un virus recombiné : en construisant un vecteur adénoviral capable d’exprimer CRE, il est ainsi possible de restreindre la disruption du gène-cible à la seule zone d’infection virale.

Les protéines de fusion LBD/CRE figurent parmi ces améliorations. La protéine CRE est alors exprimée sous forme de protéine de fusion avec le récepteur des stéroïdes (domaine LBD de fixation du ligand). Cette protéine de fusion est inactive une fois produite. Cependant, en présence du ligand, elle change de conformation et permet l’activité recombinase du domaine CRE. Le gène LBD/CRE pouvant être doté d’un promoteur spécifique d’un tissu ou d’un type cellulaire donné, il est donc possible d’entraîner la disruption du gène visé par simple injection du ligand.

En utilisant l’opéron bactérien tetracycline (tet), enfin, il est possible d’induire ou de réprimer la transcription de CRE. Le système repose sur l’opérateur tetO. En présence de tétracycline, la protéine de fusion tetR-VP16 ne peut pas se fixer à l’opérateur et le gène rapporteur (ici, le gène de la recombinase CRE) n’est pas exprimé. Une variante utilise une forme mutée de la protéine de fusion. Cette fois-ci, l’activation du gène se fait par ajout de tétracycline, et à l’inverse, l’arrêt d’injection de cet antibiotique permet d’inhiber le gène. Le contrôle temporel de la transcription est donc assuré par ce système binaire. La présence d’un promoteur spécifique d’un tissu ou d’un type cellulaire permet également de garantir le contrôle spatial de l’expression du gène CRE.

Conclusion

Parmi les programmes majeurs de biologie moléculaire mis en place ces dernières années, figure le Knock-out Mouse Project. Approuvé par le NIH (Institut National pour la Santé, USA) le 7 septembre 2006, ce projet, financé à hauteur de 52 millions de dollars sur 5 ans, a pour objectif de créer des mutations knock-out sur chacun des 25.000 gènes murins codant pour des protéines, et de regrouper ces ressources dans une banque publique mondiale. La technique knock-out permet de rendre de nombreux services en recherche. Cette approche, bien qu’exposée chez la souris durant cet article, existe également chez d’autres organismes modèles comme le Xénope, le Poisson-zèbre, et possède un équivalent chez Arabidopsis thaliana.

Bibliographie

Cours de génétique moléculaire (2005) - Master 1 Biotechnologies (Université de Nantes).

La mutagenèse dirigée chez la souris. (document Université de Provence). En ligne

Lettre "info veille biotech n°93" du 20 septembre 2006. En ligne

NIH Planning Meeting for a Knockout Mouse Project. (2005). En ligne